The influence of lysozyme and oligothiophenes on amyloid-β toxicity in models of Alzheimer’s disease

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease and the most common cause of dementia worldwide. Apart from dominantly inherited mutations, age is the major risk factor and as life expectancy increases the prevalence for AD escalates dramatically. AD causes substantial problems for the affected persons and their families, and the society suffers economically. To date the available treatments only temporarily relieve the symptoms, wherefore the development of a cure is of utmost importance. The etiology of AD is still inconclusive but many believe that small aggregates (oligomers) of the protein amyloid-β (Aβ) are central for the onset of AD. The aims of this thesis were to investigate how different molecules affect the aggregation and toxicity of Aβ. In paper I and II, two oligothiophenes were studied; pFTAA and h-FTAA and in paper III and IV the inflammatory protein lysozyme was explored. Differentiated neuroblastoma cells and Drosophila melanogaster were used as models of AD to address the issue. The results show that p-FTAA rescues neuroblastoma cells from Aβ toxicity when Aβ is co-aggregated with lysozyme. Various biophysical studies show that the coaggregation increases the formation of fibrillar Aβ structures rich in β-sheets. Noteworthy, these Aβ fibrils were more resistant to both degradation and denaturation, and less prone to propagate seeding from Aβ monomers. Furthermore, h-FTAA, but not p-FTAA, was able to protect neuroblastoma cell toxicity when exposed to Aβ with the Arctic mutation (AβArc), which probably reflects the weaker binding of AβArc to pFTAA, compared to h-FTAA. Lysozyme levels were increased in CSF from patients that were both biochemically and clinically diagnosed with AD. In mice models of AD it was revealed that the mRNA increase in lysozyme correlates to increased Aβ pathology, but not to tau pathology, indicating that Aβ could drive the expression of lysozyme. To evaluate the effect for increased expression of lysozyme, co-expression of lysozyme was achieved in flies that expressed Aβ in the retina of the eyes, or in flies that expressed AβArc in the central nervous system. In all AD fly models, co-expression of lysozyme protected the cells from the Aβ induced toxicity. Of note, flies that expressed the toxic AβArc in the CNS of the flies showed an improvement in both lifespan and activity. Finally, we demonstrate that Aβ aggregating in the presence of lysozyme inhibits the cellular uptake of Aβ and also the cytotoxic effect of Aβ. The work included in this thesis demonstrates that the oligothiophenes p-FTAA and hFTAA, and also lysozyme have the potential to be used as treatment strategies for sporadic AD, but remarkable, also in familial AD with the highly toxic Arctic mutation. The protective mechanism of p-FTAA seems to be attributed to the ability to generate stable Aβ fibrils with reduced seeding capacity, and that lysozyme inhibits the neuronal uptake of Aβ, which could prevent both the intracellular toxicity and cell-to-cell transmission of Aβ. POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING Alzheimers sjukdom är den vanligaste formen av demens och uppträder ofta sent i livet om man inte är bärare av en ärftlig mutation som orsakar Alzheimers sjukdom. Sjukdomen leder till att hjärnans nervceller långsamt förtvinar, vilket ger upphov till både fysiska och psykiska funktionsnedsättningar som så småningom leder till döden. Det finns idag inget botemedel, utan behandlingen syftar endast till att tillfälligt lindra de symptom som uppstår. Orsaken till Alzheimers sjukdom tros bero på proteinet amyloid-β (Aβ) som klumpar ihop sig (aggregerar) och ger upphov till de senila plack som finns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. Tidigare ansågs placken vara orsaken till nervcellsdöden. Idag anses mindre aggregat, eller själva aggregeringsprocessen när små enskilda Aβ peptider aggregerar och bildar större komplex, förstöra nervcellerna. Syftet med avhandlingen är att undersöka hur p-FTAA, h-FTAA och lysozym binder till Aβ, påverkar aggregeringsprocessen av Aβ och vilken effekt de har på hur giftigt Aβ är. Genom att göra biofysikaliska experiment i provrör, modellera Alzheimers sjukdom i neuroblastomceller och bananflugor samt använda hjärnvävnad från avlidna patienter med Alzheimers sjukdom har detta studerats. Delarbete I visar att Aβ som aggregerar tillsammans med p-FTAA inte längre är giftigt; p-FTAA skyddar cellerna. Den skyddande effekten beror på att p-FTAA påskyndar aggregeringsprocessen av Aβ, och de stora komplex som bildas är mindre giftiga och mer stabila än Aβ som aggregerar utan p-FTAA. I delarbete II undersöktes hur p-FTAA och h-FTAA påverkar Aβ med den arktiska mutationen (AβArc), en mutation där bäraren av mutationen i tidig ålder utvecklar Alzheimers sjukdom. AβArc som aggregerade tillsammans med h-FTAA motverkade giftigheten hos AβArc medan p-FTAA inte hade någon effekt på AβArc giftigheten. En trolig förklaring till detta är att det är en starkare bindning mellan AβArc och h-FTAA jämfört med p-FTAA och AβArc. Delarbete III visar att nivåerna av lysozym, ett protein involverat i immunförsvaret, är förhöjt i hjärnan vid Alzheimers sjukdom. I olika musmodeller av Alzheimers sjukdom påvisades att uttrycket av lysozym stämde överens med förekomsten av Aβ plack i mössens hjärnor, vilket tyder på att Aβ kan vara orsaken till ökningen av lysozym. För att undersöka vilken effekt höga nivåer av lysozym har vid Alzheimers sjukdom konstruerades alzheimersjuka bananflugor med höga nivåer av Aβ och höga nivåer av lysozym. Lysozym visade sig ha en positiv effekt på alzheimerflugorna då längre överlevnad och förbättrad aktivitet uppmättes i flugorna som hade höga nivåer av både lysozym och Aβ. I dessa flugor var Aβ bundet till lysozym, vilket påvisar att lysozym via direkt bindning till Aβ kan förändra dess giftighet. Det har tidigare visats att intracellulärt Aβ är mycket giftigt. Delarbete IV visar att Aβ som får aggregera tillsammans med lysozym hämmar det cellulära upptaget av Aβ och därigenom den giftiga verkan av Aβ. Således kan lysozym via sin Aβ-bindande förmåga förhindra cellulärt upptag och giftiga effekter av Aβ. Sammanfattningsvis visar den här avhandlingen att p-FTAA, h-FTAA och lysozym via bindning till Aβ minskar Aβs giftiga effekt. Dessa tre ämnen har därmed potential att i framtiden användas vid utvecklingen av nya behandlingsmetoder för Alzheimers sjukdom.